11. 我的基因序列与标准序列为什么有差别？

答：一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。 ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较 长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度 减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向 测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

12. 过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

答：首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的 PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的 干扰更大，很容易造成测序失败。

13. 用测序的方法检测点突变可靠吗？

答： 有的客户想用测序的方法检测点突变体，我们认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应 的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近 时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到 突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。 因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方 法检测突变体的存在不是一个好的方法。

14. 我要求5’到3’正向测序，为什么你们给我的序列是反的？

答：您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的 序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3’引物和5’引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13f，M13r这样的形式来 填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRI到HindIII”。我们手中等质粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。

15. 我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？

答：我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那么实验结果和验证实验是相同的。