Oligo DNA 的分子量和摩尔数的计算方法
一、Oligo DNA 的分子量和摩尔数的计算方法
1、一般Oligo DNA 的分子量和摩尔数的计算方法
分子量计算公式如下：
MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61
OligoDNA的分子量也可以用以下近似方法计算: OligoDNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5,则一条OligoDNA的分子量=碱基数×324.5。
例：您得到一管标为5 OD260nm的20mer OligoDNA
分子量=20×324.5=6490
质量数=5×33=165ug
摩尔数=165/6490=0.025umol=25nmmol
若加双蒸消毒水或TE buffer400ul溶解,则浓度为25nmol/400ul=62.5uM
这里的 OD 值是指 DNA 制品溶解在1ml无菌水中的260nm 的吸光度值。
2、含修饰的Oligo DNA的分子量和摩尔数是如何确定的？
Oligo DNA非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数× 碱基的平均分子量。或按下列公式计算
MW= (NA ×WA) + (NC ×WC) + (NG × WG) + (NT × WT) +(Nmod ×Wmod) ＋（Nx×Wx）+( Ni× Wi) +16×Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
3、常规碱基及常规修饰基团分子量
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Base
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Molecular Weight
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Base
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Molecular Weight
|
Base
|
Molecular Weight
|
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A
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313.21
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5ˊ -Biotin
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405.45
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3ˊ-TAMARA
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623.60
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C
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289.18
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5ˊ-(6 FAM)
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537.46
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3ˊ-Dabsyl
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498.49
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G
|
329.21
|
5ˊ-HEX
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744.13
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3ˊ-(6 FAM)
|
569.46
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|
T
|
304.19
|
5ˊ-TET
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675.24
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3ˊ-AminoModifier
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C3 153.07
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I
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314.2
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5ˊ-Cy5
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533.63
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3ˊ-AminoModifier
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C7 209.18
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U
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290.17
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5ˊ-Cy3
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507.59
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3ˊ-ThiolModifier
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C3 154.12
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S
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16.00
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5ˊ-NH2
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179.2
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3ˊ-NH2
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209.2
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5ˊ-ROX
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659.8
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3ˊ-ROX
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659.8
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5ˊ-digoxin
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722.9
|
3ˊ-digoxin
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722.9
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5ˊ-PO4
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80
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3ˊ-PO4
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569.5
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5ˊ-JOE
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666.4
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3ˊ-JOE
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666.4
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二、Oligo DNA的Tm值
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度也有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。
最适退火温度（Ta Opt ）= 0.3×(Tm of primer)0.7×(Tm of product)–25
引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃，一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。兼并碱基TM值可以折算。