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3730基因组大片段DNA 测序_Shot Gun Sequencing测序

一、Shot Gun Sequencing 测序       

1．Shot Gun 测序(鸟枪法测序）的操作方法

·用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收；

·对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理,然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化；

·进行Agarose电泳,切胶回收1kbp-2kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的3¹端加上一个A碱基；

·把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆；

·对阳性克隆(含1kbp-2kbp Insert)进行DNA测序；

·对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。

2．DNA测序量

·应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的10倍量进行计算,对每个反应的有效测序长度定义为500Bases。

如：对10kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：

测序量=10，000 Bases×10/500 Bases=200个反应

3．结果编辑

·按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对基所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段（Contig）。

4．补缺工作

·结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段（Contig）间的序列没有测定，此时应该进一步通过技术手段，解析那些没有补解明的DNA序列，进行整体DNA序列的补缺工作。

5．收费标准

·DNA文库构建费用：3，000元/文库。·DNA测序费用400元/kb。

·补缺费用：1元/Base（含DNA测序费、引物合成费、克隆费、PCR反应费等）。

6．其他说明

·病毒DNA中，特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现，可能无法测序，请理解。

· DNA序列中，有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现，此部分有可能无法测序，请理解。

· 您可以通过下载三博远志Shot Gun测序服务合同 ，发送邮件至cs@sunbiotech.com.cn订购。

7．DNA样品要求：
     1）提供纯化的DNA样品。
     2）DNA浓度≥50ng/ul，DNA总量≥20ug，无DNA降解。OD260 / 280值：1.80～2.00，DNA定量以我方凝胶电泳、紫外分析仪定量为准。
样品寄送注意事项：
     1）乙醇沉淀的DNA，可以常温运输；否则在运输过程中，须放置干冰（时间不超过72小时）或冰袋（时间不超过24小时）；运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。
     2）请仔细纯化样品，尽量避免污染。样品须保留备份，以防止出现外源DNA污染，能迅速查清原因。
     3）项目完成数据提交后，我方将不再保存样品。如果需要返还样品请在项目进行前予以说明，否则项目结束一个月后将予以清理。
 

二、限制酶切，亚克隆测序法

1．测序方法

由于Shot Gun 法测序会出现在较多的重复测序结果，因此，小于100kbp的DNA片段测序工作使用Shot Gun 测序价格太昂贵，此时比较适合于使用限制酶切、亚克隆测序法。

限制酶切、亚克隆测序法的方法如下：

·选择适当的限制酶切，对Insert DNA片段进行切断处理。

·对切断的DNA片段进行亚克隆。

·对每个亚克隆中的DNA片段进行测序。

·编辑测序结果。

·整体序列如有空缺，进行补缺工作。

2．收费标准

      0.8元/Base（含DNA测序、引物合成、克隆、PCR等全部费用）

3．其他说明

·病毒DNA中，特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现，可能无法测序，请理解。

·DNA序列中，有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现，此部分有可能无法测序，请理解。